试验前请仔细阅读说明书，本产品仅供科研实验使用。
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1、已超过受理期限的产品，如过保质期。
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3、由于客户没有仔细确认要订购的指标，导致自己的指标定错。
4、产品已使用（质量问题除外）。
组织活性氧(ROS)检测试剂盒（DHE）
一、产品简介：
组织活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针DHE进行组织活性氧检测的试剂盒。本试剂盒中的DHE ROS探针为红色荧光的活性氧探针，具有510/610nm的最大激发/发射波长。DHE ROS探针在组织中活性氧存在的条件下，被氧化生成红色荧光物质，红色荧光强度与组织内活性氧水平成正比，检测 DHE 产物的荧光强度就可以知道组织内活性氧的水平。 在激发波长510nm，发射波长610nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、等检测DHE产物荧光，从而测定组织内活性氧水平。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括过氧化氢（H2O2，Hydrogen peroxide）、羟基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、单线态氧（1O2，Singlet oxygen）、 一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO•，Peroxylradical)、过氧羟自由基（HOO•，hydroperoxyl）及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子
（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生主要是氧化磷酸化的结果，在呼吸链中，在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应，在酶或非酶作用下引发 一系列反应生成不同种类的活性氧：“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基（O2•-）。超氧阴离子遇水生成 H2O2，同时过氧化氢也可由氧气在单 胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）的作用下生成，生成的过氧化氢在髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）的催化下与 Cl-反应可生成ClO-，在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•，超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。
适用：新鲜组织， 一般最好使用新鲜组织样本检测活性氧，反映的是组织当时的活性氧状态。冻存的组织样本的ROS在长期冻存过程中会损失掉，有条件的话就使用新鲜样本，不建议使用冻存的组织样本。已经冻存的组织样本中残余的ROS也可以用本试剂盒检测。
二、产品组成：
| 名称规格 | 100T | 200T |
| 匀浆缓冲液 A | 100 ml | 2*100 ml |
| DHE 活性氧探针 | 200 μl | 2*200 μl |
| 说明书 | 一份 | |
三、自备材料：
1、荧光分光光度计或荧光酶标仪(激发波长488-535nm，发射波长610nm)
离心机，移液器，冰箱，冰盒
2、PBS 缓冲液（10mM,PH7.4 ）或者 HBSS
3、离心管，吸头，一次性手套，荧光检测专用黑色 96孔板
四、使用注意事项:
1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2、DHE染色液为 DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
3、使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使 DMSO溶液集中于管底。
4、尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
五、样本处理：
1、刚取得的新鲜组织样本用pbs洗净.
2、准确称取50mg组织，加入1ml匀浆缓冲液A，用玻璃匀浆器充分匀浆。
3、在100xg，4℃离心3分钟，弃沉淀，取上清。
六、样本检测:
1、在96孔板中加入200微升匀浆上清液、2微升DHE 探针，用移液器吹打，使之充分混匀。
【注意】:
①不同样本的活性氧差异较大，需要根据预实验结果调整探针用量。一般加入2ul探针，染色终浓度按试剂盒中探针母液的100-2000倍稀释，200-1000倍稀释适合大多数样本。最大稀释比例可至2000倍。
②如果荧光强度太强，超过了检测仪器的量程，可以减少探针用量。保证所有样本探针用量一致即可。
③以酶标仪检测为例。也可以用荧光分光光度计检测，根据所使用仪器决定匀浆液体积和染色容器。
④染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
⑤微量操作时，注意探针要有效加入匀浆液，避免没有加入。
2、在37℃避光孵育15-30分钟。
3、置于荧光酶标仪中，后于激发波长为488-535 nm、发射波长610 nm检测荧光强度。
【注意】
①或使用荧光光度计等其它荧光检测设备。
②必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
③如果荧光强度太强，超过了仪器的检测范围，可以将孵育后的匀浆上清液稀释后再检测。一般稀释5-50倍。
七、蛋白定量:
1. 另取50微升上清匀浆液，用PBS大约稀释30倍。
2. 取100微升进行蛋白定量。
八、结果处理:
以荧光强度（RFU)/蛋白浓度（毫克蛋白）表示组织活性氧强度。
【注意】:
①数据与蛋白浓度的单位无关。
②此处以蛋白浓度数据作为校正系数，对不同样品进行均一化处理。
③荧光强度强则活性氧（ROS）含量高。
④可以用实验中对照样本的荧光强度值为基准，待测组样本的荧光强度值占对照样本的百分比来比较活性氧（ROS）程度差异。
九、常见问题分析：
①活性氧结果如何分析?
ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照)。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。
②荧光强度在变化?
可以观察到荧光的逐渐增加（由于自动氧化）或减少（由于细胞中的染料损失或光漂白)。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的样本中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。
注意检测时平行操作即可。
十、存储：2-8℃保存
如果长期不用，匀浆液2-8℃保存，探针-20℃避光保存
十一、有效期：未拆封一年，拆封请尽快使用完
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